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体外诊断中常见核酸提取纯化方法有哪些

发布时间：

2024-04-11 14:57

体外诊断中常见核酸提取纯化方法有哪些

体外诊断，是指在人体之外，通过对人体样本(血液、体液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息，进而判断疾病或机体功能的产品和服务。而检测人体样本的关键步骤之一，即是样本中的核酸（DNA和RNA）纯化。核酸纯化的方法是影响所提取核酸质量的重要因素，只有高质量的核酸才能满足下游的各种应用。核酸是分子生物学的基础，而核酸提取是核酸检测乃至于整个分子行业绕不过去的门槛，很多时候一份样本的核酸提取的好坏直接决定了检测结果的有效性。

为什么需要核酸提取？

核酸提取为大量广泛研究和应用提供了答案，获得的核酸可以多种方式进行应用。准确的研究目的，决定了要提取的核酸类型；核酸的应用往往影响提取方法的选择。为了确定好的研究方法，有必要清楚了解核酸的下游应用以及任何与样品类型相关的潜在限制。虽然依据样品类型，细胞裂解方式不同，但整体的核酸提取核心原则不变：细胞或组织样品裂解，去除非核酸污染物。

核酸提取纯化原则和要求

1、保证核酸一级结构的完整性；

2、排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）；

3、核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

4、降低生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。

常见核酸提取纯化方法

1、苯酚氯仿抽提法

苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，变性降解蛋白，使DNA从细胞核中游离出来，DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。利用萃取原理，根据蛋白核酸溶于不同的试剂层，将枪头伸入不同液层内抽取所需的成分，经多次洗涤后获得纯化核酸。

缺点是由于使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大，由于操作体系大，不同实验人员操作重复性差，不利于保护RNA，很难进行微量化的操作。

2、离心柱法

此种方法是利用核酸表面会覆盖一层由水分子构成的薄膜，在高盐环境下，这层亲水膜会遭到破坏从而核酸可被吸附在离心柱上，而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离。但即便如此，离心柱纯化法仍存在缺点：

（1）高度依赖吸附膜的结合能力；

（2）洗脱不完全导致核酸流失；

（3）无法大量提取核酸。

3、磁珠法核酸分离技术

携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸。一般而言，将样品与结合缓冲液和磁珠混合，核酸与磁珠结合后，经过洗涤与磁场捕获，洗脱下来的核酸可通过PCR等其它特定方法来检测特定的DNA或RNA。磁分离法广泛应用于诊断行业，且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。

不同类型基因检测均会涉及到核酸的提取和纯化步骤。核酸提取纯化的方法中，液体法和离心柱法均会涉及到有毒有机物的使用，对环境和实验操作者均存在一定的危害。磁珠法核酸提取试剂盒，其中裂解液可以快速裂解样品，使样品的 DNA 游离在溶液中，通过特异性吸附与磁珠结合，经过洗涤过程除去无机物、有机物等杂质，使用洗脱液将核酸从磁珠上洗脱下来，且不使用苯酚、氯仿等有毒试剂；操作简单方便，全过程仅在一个离心管内完成，避免微量样品的损失，且不容易交叉污染；兼容性广，适用于常见的分子生物学样品，包括细菌、昆虫、各种动物组织、口腔细胞、毛发、组织中的细菌和病毒、植物组织等；从操作方面来分析，利用磁珠固液相快速分离的特性，实现简便快速的操作，也促进了自动化的进程和应用的推广。