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数字PCR技术的原理、操作与应用

发布时间：

2025-03-03 14:37

1.ddPCR的实验原理

数字PCR（Digital PCR，ddPCR）是一种先进的核酸分子绝对定量技术，其核心在于将样品分散到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增。每个微反应单元中可能包含1个或0个目标分子，通过PCR扩增后，利用荧光信号检测每个单元的反应情况。最终，根据泊松分布原理计算出目标分子的绝对数量。与传统的实时荧光定量PCR（qPCR）相比，ddPCR不依赖于标准曲线，能直接进行绝对定量。

2.ddPCR的操作步骤

（1）样本制备：首先需从目标组织或样品中提取核酸，如gDNA或mRNA样品，并将其转化为cDNA。

（2）反应体系配制：将提取的核酸样品与预混液、靶标特异性引物和探针混合。对于ddPCR，还需加入微滴发生油。

（3）微滴制备：将配制好的反应液通过微滴发生器制备成成千上万个nL级的微滴。每个微滴中可能包含1个或0个目标分子。

（4）PCR扩增：将微滴化的反应板放入PCR仪中进行扩增。在扩增过程中，目标分子被扩增，荧光信号逐渐显现。

（5）微滴检测：扩增完成后，将反应板放入微滴分析仪中，逐个检测每个微滴的荧光信号。

（6）数据分析：软件自动分析每个微滴的荧光信号，根据阳性微滴的比例和泊松分布计算目标分子的绝对数量。

3.ddPCR的结果分析

在ddPCR实验中，结果分析主要依赖于微滴的荧光信号检测。每个微滴的荧光信号分为阳性（目标分子存在）和阴性（目标分子不存在）。通过统计阳性微滴的数量，并结合泊松分布公式，可计算出样品中目标分子的绝对拷贝数。此外，数字PCR技术具有高灵敏度和高特异性，能检测低丰度的目标分子，并且不受扩增效率的影响。

4.数字PCR的实验应用

（1）基因突变检测：能够检测低丰度的突变基因，适用于肿瘤早期筛查和监测。

（2）拷贝数变异检测：用于分析基因组中的拷贝数变异，如染色体异常。

（3）病毒和微生物检测：能够精确检测病毒载量和微生物数量，适用于传染病的诊断和监测。

（4）转基因食品检测：用于检测食品中转基因成分的存在。

（5）单细胞研究：能够从单个细胞中检测基因表达和蛋白质水平。

（6）下一代测序（NGS）验证：用于验证NGS测序结果的准确性和可靠性。

综上所述，ddPCR技术以其高灵敏度、高准确度和绝对定量的优势，在生物医学研究和临床诊断中展现出巨大的应用潜力。随着技术的不断发展和成本的降低，ddPCR有望在更多的领域得到广泛应用。

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