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片段分选的基本策略及其应用

发布时间：

2025-02-05 10:28

磁珠纯化核酸原理是基于固相可逆固定化技术（Solid-phase reversible immobilization，SPRI），其中的作用机制目前还不是很清楚。而盐桥理论是目前比较科学的解释，即在较高浓度的醇和盐溶液夺取DNA分子外面水化层的水，导致DNA分子发生聚集沉淀，使得带负电的磷酸基团裸露出来。通过盐离子与磁珠表面的基团形成“盐桥”，或者也叫“电桥”，使得DNA吸附到磁珠表面。

异丙醇和乙醇沉淀作用太强因此片段分选中一般不选用，而是选择非离子型水溶性高分子聚合物PEG也就是聚乙二醇作为沉淀剂，且由于PEG带粘性，使得缓冲液中磁珠获得良好的悬浮性。在DNA 结合过程中使磁珠更充分的与DNA接触，同时PEG也不易造成蛋白变性和非特异性吸附。但是PEG的DNA沉聚效果容易收到pH、温度等的影响，温度过低PEG也不易与水完全互溶，所以磁珠一般都要求室温平衡后再用，其磁珠缓冲液里也会加一些低浓度的pH稳定剂，如Tris-HCl等。

图1：影响DNA回收率的因素[1]

DNA越长，表面裸露出来带负电的磷酸基团越多，整条分子带的负电就更强，更容易吸附到磁珠，只需要较低浓度的PEG和NaCl，就可以回收；DNA越短，就需要更高浓度的PEG和NaCl，将其表面的水化层破坏得更彻底，裸露出来足够多带负电的磷酸基团，才能被磁珠吸附住，从而回收回来。所以如果想回收较短的DNA片段时，需要加入的磁珠体积更大（图1所示）。

因此片段分选的一般步骤是，第一轮用比较稀的磁珠缓冲液吸附走大片段，取上清后进行第二轮添加磁珠缓冲液吸附指定的片段，这样就得到想要的片段DNA。目前市面上大多数片段分选的方案都是使用羧基磁珠配合不同浓度的盐离子和百分含量的PEG来回收不同长度的片段，当然也有另一种方案就是艾铂图（Apostle）的先用羧基磁珠（图2所示Substrate A）在一定浓度的盐离子和PEG环境中吸附大片段，之后用硅羟基磁珠（图2所示Substrate B）在一定浓度的盐离子和PEG环境中吸附小片段[2]。

图2：片段分选策略[2]

片段分选的磁珠法是一种高效、快速且特异性高的技术，在NGS文库制备过程中，片段分选是关键步骤之一。通过片段分选，可以确保文库中的DNA片段大小符合测序平台的要求，从而提高测序数据的质量和分析的准确性。在分子诊断领域，片段分选技术用于提高检测的灵敏度和特异性。片段分选磁珠也可以用于PCR产物的纯化，以用于下游实验。

参考文献：

[1] LIU D, LI Q, LUO J, 等. An SPRI beads-based DNA purification strategy for flexibility and cost-effectiveness[J/OL]. BMC Genomics, 2023, 24(1): 125. DOI:10.1186/s12864-023-09211-w.

[2] ZHANG B, ZHAO S, WAN H, 等. High-resolution DNA size enrichment using a magnetic nano-platform and application in non-invasive prenatal testing[J/OL]. The Analyst, 2020, 145(17): 5733-5739. DOI:10.1039/D0AN00813C.

 

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